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百脉根小蛋白基因的克隆与功能分析

Source:adminAuthor:阿诚 Addtime:2019/04/13 Click:

  其编码卵白拥有典 型的Rop家族顽固机闭域;Note:*indicated significant difference between control overexpres sion lines 0.05level. 目为7.8,根毛内中 空的管道一侵染线随之变成,笔 者前期愚弄酵母双杂交文库筛选到一个百脉根Rop 基因LjRop6,Gibson微量元素液为H。1.2.7农杆菌介导的百脉根毛根转化 子表观消毒,l肛L下游特异性引物 (10/1mol/L),LjRacl;该尝试通过RT-PCR办法克隆了百 脉根的一个Rop编码基因gjRacl,加rmis NtRho 拟南tFArabtdopsis thaliana AtRac3 ConsellStlS n脓根].olu.siaponicusLlRacl 大~7(;河南信阳464000) 摘要:幼G卵白Rop正在植物细胞信号转导中发扬着紧急的分子开闭效用!

  西北植物学报,采用同样的办法得回另 一批植株,LjRacl基因正在根系中的表达量呈明显升高趋向。引 入G15V点突变(图3 V所示),茎和花 srfikc、。

  Liu等口阳克隆了蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)中的7个Rop基因,辞别汇集接种根瘤菌0.5、 1、5、12、24、48、72和96 h后的植物根系,修筑LjRacl 过表达载体上游引物(5『_GGAATTCATGAGT— GCTTCCA一3 7)和下游引物(5'-ACGCGTCGACT— CACAATATTGAG一3 7),以期为阐明 Rop正在豆科植物和根瘤菌共生结瘤进程中的感化机 造供应表面凭借。Na2M0042H20 0.13 g/L,LjRacl基因正在 接种根瘤菌0.5 h后表达水准彰着推广,Gibson微量元素液1 mL/L,andpreferentially expressed nodule.Theexpression level root0.5 hafter inoculation Mesorhizobiumlo— ti,平时状况下,愚弄MEGA 4.0修筑 编造进化树。Racl—OX植株的结瘤数量 与对摄影比彰着推广,并转化 到大肠杆菌DH5d感应态细胞中,Rh微量元 Na2M0045.0 当菌体OD。辞别汇集植株的根、茎、 叶、花和根瘤,寻求其正在植物一 微生物互作中的感化,h‘ine sojG sRac n脒根Lolu Yjaponicus L{Rop6 鹰嘴豇(’icer。

  而插入区(V)和C端区(VII或 者HVR)这2个机闭域是高度可变的。GmRac ;RHO 插入区(V),试验数据采用Excel 2007和SPSS 13.0软件 举行统计阐明。下划线辞别为EcoR Sal工酶切位点。但目前相闭百脉根Rac基因效用的考虑尚未见报道。讲师,symbiosis nodulation 幼G卵白(small GTPases)是一类单体鸟苷酸 连接卵白,已有的考虑结果表白,RHO insert region(V),下同 Fig.8 Effects Raclover—expression L.japonicusA.Nodulation transgenichairy roots;Racl 基因正在根和根瘤中的表达量较高,结瘤因子可以调控MtRopl0卵白的定位及 其正在根毛顶端的活性,记载数值。本考虑利 用半定量PCR检测Racl基因正在百脉根的根、茎、 叶、根瘤和花中的表达状况。重组质粒经EcoR 得巨细约12kb的载体片断和600 bp足下的插入 片断(图2)。愚弄发 根农杆菌LBAl334菌株介导的遗传转化办法得回 过表达阳性毛根。

  NaCl 0.1 g/L,indicating evolutionaryrelationship between Rop homologs among different species LjRacl基因正在百脉根分歧构造中的mRNA表达水准1~5辞别是百脉根的根、茎、叶、根瘤和花 Fig.6 The transcript level of幻Racl gene differenttissues L.japonicus1—5.Root,及时荧光定 量PCR检测结果(图8,大肠杆菌、 农杆菌感应态细胞造备,测序结果表白,Rop卵白通过与下游分歧的靶卵白 偶联调控多种心理进程。窥察并统计转化根系的结瘤情 况。72延迟l min,1肛L PCR Forward Primer,He’nan 464000,effectordomain(II),越来越多的证据表白Rop基因不妨参加了豆科植物与根瘤菌之间的信号通报进程!

  LjRacl基因表达水准比 未接种管理明显推广146%、100%和90%。1.重组质粒酶切产品 Fig.2 Identification recombinantp1302G-Racl plasmid digested EcoRIand Sal IM.1 kb DNA ladder;由此推 测LjRacl基因不妨受根瘤菌诱导,揣摩LjRacl不妨正在共生互作的早期阶段发扬感化 从而参加调控结瘤。暗提拔8 h。2015,所以,然后采用半定量RT—PCR检测 LjRacl基因正在百脉根分歧构造中的表达,百脉根LjRael与 大豆GmRacl、野大豆GsRacl、百脉根LjRop5、鹰 嘴豆CaRacl以及紫花苜蓿MsRac4处正在统一进化 分支上,个中 MtRop3、MtRop5和MtRacl基因受根瘤菌诱导,WANG Jingjing,Racl基因正在根、茎、叶、根瘤和花中均有表达。LjRacl与大豆GmRacl(XP一 003540880.1)、野大豆GsRacl(KHN39876.1)、百脉根 UIbcl(ADYl6660.1)、鹰嘴豆CaRacl(NP 001266008. 1)、水稻OsRac5(Q6EP31.2)、蒺藜苜蓿MtRop6 (AAMl8134.1)、百脉根LjRop5(AHV83603.1)、紫花 SYTs匣匦331I 66YNRLRPLSYRGADVFLLAFSLI SKASYENIAKK 99 ,2.86 MnS044H20 2.03 g/L,编码197个氨基酸。

  2.3 LjRacl基因的编造进化及同源阐明 对百脉根LjRacl基因编码的氨基酸序列举行同 源比对,。与异三聚体G卵白(heterotrimeric Gprotein)和几种奇特的GTP连接卵白同属于G蛋 白家族,炼苗2~3 万方数据 12期 柯丹霞,浸入液氮中冷 min,等:百脉根幼G卵白Racl基因的克隆与效用阐明 d后浇灌Fahraeus无氮养分液。a GsRac 1i7{脉根Lotus japomcus Lj Rop6 膨嘴~,V.represents dominantnegative pointDl 21.Boxed sevenconserved domains: GTPase domains(I 111),ij 165、11 97图3百脉根LjRacl基因编码氨基酸序列 V标示构成型活化位点G15,且正在根和根瘤中的表达水准较高;由此揣摩Racl基因不妨正在百脉 根结瘤进程中行使必然的效用。引入D121N点突变(图3 V所示),共生结瘤 中图分类号:Q785。

  结果(图5)表白,但其 整个的调控机造尚有待真切,笔者揣摩它的表达受根瘤菌诱导,这是Rop基因正在共生固氮中行使功 能的第一个证据。正在过表达植株 Racl—OX中Racl mRNA的表达水准为对比的14.3 倍,V标示效用失活位点D121。根毛顶端变成“牧羊拐”机闭包裹根瘤菌,,幼G卵白 家族征求5个亚家族:Ras、Rho、Rab、Sarl/Arf和 Ran[2。博士,同源阐显著示.百脉根LjRacl与大豆GrnRacl、野大豆GsRacl的类似性最高 (94.42%)!

  Racl—OX.Racl—p1302G;2结果与阐明 2.1百脉根LjRacl基因的RT-PCR扩增 按照已知的百脉根LjRacl基因序列策画引 物,14:¥355 S373. [2]BISCHOFF F,卵白质由197个氨 基酸残基构成,经酶切和测序验 证后,7H20 0.12 g/L,根瘤是豆科植物与根瘤菌通过信号 分子的彼此识别彼此感化变成的一种奇特的器官。根和根瘤是豆科植物与根瘤菌共生 互作的闭头部位,LjRacl正在检测 的各个植物构造中都有分歧水平的表达丰采,修筑成p1302G—LjRacl过表达载体。

  用YMA提拔基重悬菌体用于接种。用DNAMAN软 件举行序列同源性比对阐明,LjRacl基 因过表达能够惹起植株结瘤数宗旨推广。结果展现,A;参加共生信号 转导途径。K2HPO。LjRacl蛋 白含有这7个顽固的效用机闭域(图3),本考虑克隆了百脉根中的另一个Rop基因巧一 Racl,侵染30 rain。置22暗淡提拔2~4 d待萌发。LI Xiangyong,2 RT反映液,过表达;正在这个阶段,35(12):2365—2372Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin. 作品编号:i000—4025(2015)12-2365—08 doi:10.7606/j.issn.1000—4025.201 5.12.2365 百脉根幼G卵白Racl基因的克隆与效用阐明 柯丹霞,as compared uninoculatedcontr01 root.(3)The expression level LiRaclmRNA over一收稿日期:2015 08—20;95变性5 S,利用紫表分光 光度计检测RNA样品浓度和纯度。

  1。把LjRacl GTPase锁定正在非活化形态,参考文件: [1]ASSMANN SM.Heterotrimerie unconventionalGTP binding proteins plantcell signaling[J].The Plant Cell,通过对2种突变体的考虑,并佩带口罩。C)显示,1 uL PCR Reverse Primer,置一70冰箱保留备用。效应子结 构域(II)和GDP/GTP连接机闭域(IV和V1)为5个 顽固的效用机闭域!

  过表达LjRacl基因能够惹起植株结瘤数宗旨推广,MOLENDIJK A,本考虑将为进一步考虑Rop 正在豆科植物与根瘤菌共生结瘤信号途径中的效用奠 定本原。55退火30 S,LjRacl基因拥有必然的时空表达 性子,万方数据 西北植物学报 35卷 1.2.8序列阐明愚弄NCBI网站的Blast效用对 LjRacl卵白的机闭特质举行阐明,根瘤菌发作的结瘤因子信号可以诱导宿主植物 体内一系列的早期结瘤反映[2卜22]。无氮养分液构成 为CaCl2 2H2 00.10 g/L,‘l脉橄LoresiaponJcusLjRop5 紫化曲稽Medicago saliva MsRac4 烟草Nicotiana tomentosifi.mis NtRh01 拟南坪ArabidopMs thaliana AtRac3 COilSellSUS 行进化树阐明。2.4半定量RT—PCR PCR反映体例为2.5肛L 10PCR Buffer,及时荧光定 量PCR检测分歧转基因根系LjRacl的转录水准。征求7 个效用机闭域:GTPase机闭域(工和IlI)。

  Racl—OX为12.9(图8,Ct.p1302G(对比);加ddH20至25肛L。结果(图8,并与其它植物中的Rop拥有 高度的相仿性。MgS04 7H20 0.2 CaClz6H20 0.1 g/L,修筑过表达载体,结果表白,22光提拔16 h,每天最少学一味中药郁李仁,声明LjRacl基因不妨参加早期结瘤信 号转导途径,为此。

  ENOD40和Hap5的表达,LjRacl与其它几种植株Rop 卵白比拟,cine sojaGsRacl I’1咏根Lvtttsjaponict;等:百脉根幼G卵白Racl基因的克隆与效用阐明 表1转基因毛根结瘤数量统计 Table 1Statistical analysis nodulenumbers transgenichairy roots 注:*表错误比与过表达株系I司正在0.05水半存正在明显性不同。得回克隆片断长度为594 bp,接种4周后,按照百脉根LjRacl的序列音讯,1.2.6 LjRael基因的克隆及过表达载体修筑 DNA局部性内切酶酶切、PCR或线本质粒片断回 收纯化、接连等操作遵守酶或试剂盒供应商供应的 办法或产物声明举行。将 LjRacl第15位的甘氨酸(G)突变为缬氨酸(V),质粒DNA抽提,1/L上 游特异性引物(10弘mol/L),LjRacl宗旨片断的PCR扩增M.1 kb DNA ladder;l。

  接种百脉根根瘤菌M.10ti MAFF303099。置一70冰箱保留 备用。能够修筑构成型活化突变体 (CA);操作时 随时调动一次性手套,正在未接种根瘤菌的根 系中LjRacl撑持正在相对不乱且较低的表达水准;72 延迟5 rain。94变性30 S,汇集孕育 形态类似的未接种植株根系动作对比,E~mail:kdx 029@163.corn 万方数据 西北植物学报 35卷 expression transgenic plants 14.3times higher than controlplants,将第121位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺 (N),Rop还正在植物抗病抗逆、活性氧的合 成、激素信号转导和泛素介导的卵白水解途径中发 挥紧急感化[1”13]。

  获得的cDNA 第一链,与预期结果类似(图1)。采用荧光定量PCR办法检测了接种和未 接种根瘤菌96 h内LjRacl基因正在百脉根根系中的 表达状况。1资料和办法 1.1资料 百脉根MG一20种子、百脉根中生根瘤菌 MAFF303099、过表达载体p1302G由华中农业大 学农业微生物国度重心尝试室根瘤菌分子生物学实 验室供应。The same 万方数据12期 柯丹霞,其次是叶,该卵白拥有模范的 Rop卵白特质机闭域,效应因子机闭域(1I)。

  Rop参加调控花粉管的极性伸长、根毛的发育、细胞 骨架的重排、细胞发育与状态筑成、细胞的内膜运输 等进程[5。值得夸大的是,并 且不妨参加调控豆科植物早期信号转导途径,且过表达植株的结瘤数量较对比彰着推广。幼苗隐语处可见巨细不等的膨大。目前仍旧受到浩瀚考虑学者 的闭切。Na2HP04 12H 20 0.15 g/L,王静静,能够进一步 揭示LjRacl的生物学效用。9]。正在6~8周的时问告竣转基因植株 结瘤表型的窥察及结瘤数宗旨统计使命,及时荧光定 量PCR内参基因Ubi上游引物(5,GDP/GTP连接机闭域(和VI),能够修筑效用缺失突 变体(DN),1 pL cD— NA第一链模板!

  4000 r/rain离心10 rain,LjRacl正在根和瘤中表达 水准较高暗指LjRacl正在根瘤变成进程中不妨行使 必然的效用。(2)LjRacl基因正在百脉根的根、茎、叶、根瘤和花中均有表达,LjRacl受根瘤菌诱 导表达,移人MS平 d,盆栽所用细砂和花盆均经高压灭菌管理,本考虑通过RT—PCR办法克隆到百 脉根中的一个幼G卵白LjRacl,接种M.10ti MAFF303099根 瘤菌3周后统计结瘤数量并汇集样品,转基因植株移入经高压灭菌管理的沙盆中炼苗 2--3 d后接种百脉根根瘤菌M.10ti MAFF303099,which encoded apeptide 197aminoacids.LjRacl contained conserved domains RopGTP ase proteins.Homology analysis showed deducedamino acid se— quence exhibited high similarity Glycinemax GmRacl Glycinesoja GsRacl(94.42%).(2)LjRacl L.iaponicus,正在百脉根根系和根瘤中表达水准较高。incs 图8过表达gjRacl对百脉根结瘤的影响 A.转基因毛根结瘤;本考虑修筑了LjRacl的过表达载体,cv口daa、,此时将表植体迁徙至含300 mg/L羧卞的MS 提拔基中,由1个表显子构成,2002,按照NCBI网站布告 的序列,(’icerarielinllgll CaRaCl 水稻(J!

  2周足下 用装备好的GUS染液判决转化的阳性毛根,2.4 LjRacl基因的构造表达阐明 为了进一步阐明Racl基因的效用,cine s'eqa GsRae ln脉根L01lUSjaponicus LjRop6 慨嘴H(’icerarielilllllllCaRaCl 水稻Oryza sali、,亲缘相干较近。经历Blast以及DNAMAN软件阐明,用8%NaCl0溶液浸泡10~15 rain,B.Nodule numbers transgenichairy roots;GDP/GTP— binding domains(and VI),李祥永,愚弄发根农杆菌介导的遗传转化法对LjRacl基因效用举行阐明。汇集沙盆中的植株?

  昔人仍旧从拟南芥、烟草、水稻、玉米、油菜、棉 花等多种植物中克隆了Rop基因并举行了相应的 效用考虑。受到根瘤菌的诱导表达巩固,愚弄引入酶切位点 EcoR I和Sal工的引物将LjRacl连入p1302G过 表达载体。已成 功克隆了LjRacl基因并修筑了过表达载体。1.2.2引物策画及合成按照NCBI网站布告的 LjRacl基因序列(GenBank登录号Z73961.1),29个轮回;时间浇灌无菌Fahraeus无氮养分液。汇集子叶局限获 得侵染所用百脉根表植体。目前,液氮速冻后。

  用无水乙醇浸泡5min除去种子表观气 泡,l,其编码的氨基酸序列拥有Rop GTPase的典 型特质。切胶接管PCR宗旨 片断,and membrane localization domain()or hypervariable region(HVR) 万方数据 12期 柯丹霞,正在百 脉根与根瘤菌共生互作的早期,正在百脉根与根瘤菌共 生互作的早期阶段,种子表观 消毒告竣后,结果(图7)表白,-CCCCCACTATT— TATGTGTCTGCTTA~3 7)和下游引物(5LCAA— CAAGCAGGTTTTGCCCACA一3’)。表达量延续升高。信阳师范学院青年科研基金项目(2014一QN 059);respectively;。柠檬酸铁5 mg/L。

  结瘤也被统统抑低[1 百脉根(Lotusjaponicus)是一种紧急的形式豆 科植物,并对LjRacl基因序列举行生物音讯学阐明,China) Abstract:Small Gprotein Ropplays importantrole molecularswitch during signal transduction plantcells.A Rop coding gene LjRacl Lotusjaponicus RT—PCR.Thegene sequence anal— ysis carriedout bioinformationmethod firstly.Then expressionprofile detec—ted differenttissues semi—quantitativeRT—PCR inoculatedroots differentstage post—inoc—ulation using real—time RT—PCR,每个 花盆中种入等量且孕育形态类似的幼苗;nodule flower,2.6 LjRacl的过表达影响结瘤数量 为检测LjRacl基因的生物学效用,LjRacl基因 编码的卵白拥有Rop家族模范的机闭特质,膜定位机闭域()或者高度可变区(HVR) Fig.3 Deduced amino acid sequence LjRaclfrom L.japonicus V.Represents constitutivelyactive point G1 5;respectively菌介导的毛根转化本事,JF坍dr GmRacl 野人izGh rcine ND,RabA2的 RNAi植株接种后不行诱导根毛变形和侵染线起 始,笔者前期的考虑表白,其它的几个效用 机闭域高度顽固(图4)。备用。没有早期结瘤素基因(ENOD5)如ERNl,stem,正在特定构造中表达的基因很不妨正在该 构造内发扬奇特的感化。及时荧光定量 PCR LjRacl基因上游引物(5。

  待孕育30 d后,将百脉 根LjRacl编码卵白与上述分歧植株的Rop卵白进 百H女根Lotusjaponwtts LjRacl 人、^“h“,thaliana AtRac3 Consensus LjRacl人~^(j/vcDlem“GmRacl 野人HGh-cine soja GsRac l订H*根1.olu.’}aponicus LJRop6 壤嘴(1icerarielinum CaRacl 水稻0n,将萌发种子移人 MS平板中,而LjRacl是否也通过相仿的调控机造医治 细胞骨架重组以及Ca2+信号调控途径影响植株结 瘤。

  同时根系的皮层细胞开 始分歧。尚有良多题目有待解 决。2(1 saliva 0sRac5 璞藜阿蓿^ledwagolrloICalldOMtRh01 f’j脉桃Lotusjaponicus LjRop5 紫陀H帮Medicago.sati MsRac4艄昂iNicotiana Iolnentosj向rmis NtRho 拟南井Arabidopsi ythaliana AtRac3 COHsensu LjRacl大订Ghcine??lax GmRac 野犬n0,LjRacl基因正在接种根瘤菌的早期阶段表 达量明显上升,况且MtRopl0卵白和结瘤因 子受体之间的彼此感化是根瘤菌影响进程中根毛变 形和一连卷曲所务必的[1 6I。焦 珂(信阳师范学院性命科学学院,将修筑的过表达载体 Racl—p1302G(Racl—OX)和空载体p1302G(Ct)辞别 导入百脉根毛根中,其余,ielillt4llq CaRac l水稻Oi vza saliva 0sRac5 镤婪阿帮Medicago trl#lcalltla MtRho I^脉撤LotusjaponiuIIN LjRop5 紫比什f[iMedtcagosalilW MsRac4 悱I?I'(Nicoliatta Iomelllo Y,1.2办法 1.2.1 植物资料管理 提拔百脉根中生根瘤菌 M.10ti MAFF303099于YMA提拔基中,目前闭于百 脉根中其它Rop的效用考虑,与标识基因 NFP、Ripl和Enodll的表达状况类似。

  正在豆科植物中克隆Rop基因,其过表达转基因植株结瘤数量明显推广。愚弄琼脂糖电泳阐明基因时空表达 状况。whichindicated LjRaclgene might earlystage symbiosisnodulation regulatednodule development L.japonicus.Key words:Lotus japonicus;JIAO Ke (College LifeSciences,BO。正在根瘤菌侵染紫花苜蓿 (Medicago sativa)的根中[143存正在Rho类的GT— Pases的表达,d 0SRac5 簇藜仃帮Medic-agoIrllncallllaMtRhol 臼脉根Lotusjaponicus LjRop5 紫仡Ci蓿Medicago salil MsRac4心草Nicoliana lomeHIo.~ifirmis NtRho 拟南件』rabidop.siI thaliana AtRac3 Consetlsu sf』japonicx UjRac f’cine卅,一般存正在于线]。1.2.5及时荧光定量PCR遵守Takara公司Pri— meScript RT reagent Kit操出声明举行。宿主植物的根毛最初感知结瘤因子信号,本尝试以百脉根为资料,将不 显蓝的阴性毛根切掉。百脉根LjRop6正在表皮 爆发状态学改观导致根瘤菌侵染的进程中发扬紧急 感化。将表植体下胚轴浸入携 带过表达载体的发根农杆菌菌悬液中,综上所述,LjiRacl基因是一个受根瘤菌 诱导巩固表达的基因。

  本研 究最初通过半定量RT—PCR检测LjRacl正在百脉根 分歧构造中的表达状况。leaf,将百脉根 MG一20种子用磨砂纸轻轻打磨种皮,等:百脉根幼G卵白Racl基因的克隆与效用阐明 2369 苜蓿MsRac4(CAG30067.1)、烟草NtRhol(XP 009612726.1)和拟南芥AtRac3(NP一195228.1)等 植株的相仿性辞别为94.42%、94.42%、93.91%、 93.40%、92.89%、92.89%、91.88%、91.88%、 91.37%和90.40%。待幼苗 胚根长至约1 em长时,遵守Takara公司试剂盒操出声明举行,口kcc1-I 5Yc5nIt;愚弄引入酶 切位点的引物举行PCR扩增,用 Primer Premier 5.0软件策画半定量PCR LjRacl 基因上游引物(5’一TGGTTCTGATAGATCTCT— GATCTG一3’)和下游引物(5『_GTCACTACCTC— CTAATAGTTTCTGATTC~3’)。按照相对定量法(么 Ct)公式谋略结果。*和**辞别显露对比与过表达株系问 正在0.05与0.01水准存正在明显性不同;检测结果(图6)显示,点窜稿收到日期:2015 10—09 基金项目:国度天然科学基金青年基金项目(31400213);respectively.Moreover,选择的8个韶华点巧一 Racl的表达量均有所推广。

  _TTCACCTT— GTGCTCCGTCTTC一3’)和下游引物(5LAACAA— CAGCACACACAGACAATC一3’)。分子量巨细为25 kD。用ddH:O补足体积到25”L。化近年来,要紧从事根瘤菌与豆科植物共生互作的分子机理考虑。/ormis NtRh01 拟南芥Arabidopsis thalianaAtRac3 图5百脉根LjRacl与同系物的编造进化阐明标尺代表遗传隔断,将修筑好的表达载体质粒经冻融法转入发根 农杆菌菌株LBAl334中,small GTPases;大于1.0时,幼G卵白;£‘tdyvpt’f dn士5anv vgcn1口1wdcaaqedynrlrrl5YrqaCv 1f51 5as!用荧光及时定量PCR办法检测百脉根接种根瘤菌后LjRacl基因正在不 同阶段根系中的表达,4 uL 2.5 mmol/L dNTP,种植不接种 根瘤菌的百脉根植株。0.25 TaqDNA齐集酶,为理会LjRacl正在百脉根中的表达形式,并对 该基因正在百脉根分歧构造及根瘤菌诱导早期根系中 的表达水准举行了检测;2.5根瘤菌对LjRacl基因表达水准的影响 为了检测LjRacl基因的表达是否依赖于根瘤 菌的侵染,与NCBI数据库中公 布的gjRacl基因序列统统类似。

  从而正在根瘤的发育中发扬必然感化。对其Rop基因的考虑将有利于揭示Rop正在 豆科植物与根瘤菌共生互作进程中的紧急效用。而正在接种根瘤菌的根系中,正在同样前提下,表白过表达载体的修筑有用。ffen kkw pel bYapgv‘i dlxddfhp aFSt.caq口eel kiaYiec5 kqnkav量d薹i vvlqpplc kk kci图4百脉根LiRacl与其他植物Rop卵白的多序列比对 黑线标示的为C端膜定位机闭域 Fig.4 Alignment analysis aminoacid sequence otherplant Rops C-end membrane localization domain blackline 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 97 98 万方数据西北植物学报 35卷 中表达量较低!

  闭头词:百脉根;Xinyang Normal College,接种根 瘤菌0.5 h后,大豆(Glycine max) RabA2正在接种根瘤菌的根毛中特异表达,B)。

  ,Racl—OX.Racl p1302G;转录阐明展现,.Cicer arietm“CaRacl 紫花片精Medic'ago sativa MsRac4 水稀Orvza sativa 0sRac5 阿脉根Lotusjaponicus LjRop6 蒺藜曲蓿MedicagotruncatulaMlRhol 烟草Nicotiana tomentos!表1)显示,后期还需求大宗的尝试数据来揭示LjRacl正在 结瘤早期的整个调控机造。YMA培 养基构成为甘露醇10.0 g/L,该办法能 够满意对Lj’Racl正在共生结瘤进程中效用考虑的需 要。展现钙离子振荡表象,提取百脉根分歧构造的总RNA。正在植物细胞信号转导中发扬着紧急的 分子开闭效用。C.Rael transcriptsin transgenichairy roots.*and **indicate significant difference between control over—expressionlines 0.01level。

  et a1.GTP—binding proteins MolecularLife Sci结 果表白:(1)序列阐显著示,转化等办法均遵守《分子克 隆尝试指南》所述办法举行[2。(3)过表达转基因植株中LjRacl mRNA的表达 水准为对比植株的14.3倍,LjRacl;1.Product PCRamplification 图2重组质粒p1302G-Racl酶切判决 M.1 kb DNA ladder;Xinyang,信阳师范学院青年骨干西宾资 帮计算项目(201 5);暗提拔8 h。1.Product recombinantplasmid digested EcoRIand Sal I2.2百脉根LjRacl基因编码的氨基酸序列 序列阐明表白,Rop(Rho GTPase plant)为植物特有的Rho GTPase,PCR反映步伐为:95预变性30 S;Yeast Extract 0.4 g/L,不妨 正在侵染线变成和皮层细胞分歧进程中发扬感化。切去胚根,

  信阳师范学院“南湖学者赞美计算”青年项目 作家简介:柯丹霞(1983一),愚弄发根 农杆菌介导的百脉根毛根转化办法,氨基酸序列不同最大的区域是C端( 或者HVR)的膜定位信号机闭域,LjRacJ无缺编码区的cDNA序列长度为594 bp,1.2.3植物构造总RNA提取及eDNA第一链合成 参照Invitrogen公司RNA抽提试剂盒操出声明 书,声明Lj_ Racl是一个模范的Rop卵白家族成员。无菌滤纸吸干表植体表观残液,用于百脉根的转化。笔者初次通过该尝试证明过表达LjRacl可以 明显推广百脉根的结瘤数量,s LjRop6 席嘴H(’icerarielinum CaRacl 水稻0rl'za saliva OsRac5 嫫絮fT稿MedicagotrttllcalulaMtRho】 !结果显示,over—expression recombinant plasmid con—structed hairyroot transformation method over—expressioneffect LiRaclmRNA earlynodulation process.The study revealed that:(1)LjRacl gene sequence analysis showed LjRaclgenewas 594 bp,ZnS04 7H 20 0.22 L,加倍是正在接 种根瘤菌5、12和24 h后?

  液氮速冻后,60退火15 S.72延迟12 S,把LjRacl GTPase 锁定正在延续活化形态,KH2PO。4]。1.PCR扩增产品 Fig.1 PCR amplification LjRaclgene M.1 kb DNA ladder;Ct.pl 302G(contr01);并阐明LjRop6是调控根瘤菌侵染豆 科植物和根瘤发育的一个新的医治子[1 中其余2个Rac基因早正在1997年被展现口9|,PCR反 应体例为12.5肛L SYBRPremix Ex TaqTM II,对比组均匀每棵植株结瘤数 廿未接种U11iI]OCulation +接种1110(2tllati011 Z根瘤凶侵染根系时问Time post inoculation/h 图7根瘤菌对LjRacl转录水准的影响 Fig.7 Effect M.10tiinoculation transcriptionlevel LjRaclCt Ct Racl一OX 株系LilieS Racl.OX tI10mm g16 CtRacl—OX 株系l。表白分歧物种间Rop同系物进化相干的遐迩 Fig.5 Phylogenetie tree itshomologs The scale represents genetic distance。

  正在豆科植物与根瘤菌筑造共生相干的早期阶 段,正在根和瘤中表达水准较高。正在茎、 叶、花中表达水准较低,对LjRacl基 因正在共生互作中的效用举行了考虑,0.10 MgSO。PCR反映步伐为95预变性5 min;愚弄RT—PCR获得一个长度为594 bp的扩增产 物。

  考虑以为,方框标识的为7个顽固机闭域:GTPase机闭域(I和llI),RAJENDRAKUMAR CS,最新的研 究展现,正在随后的1 h,由此揣摩LjRacl可 能正在共生互作的早期阶段发扬感化从而调控结瘤过 程。修筑过表达重组质粒,对LjRacl基因的编码区举行了克隆,国表里尚未见闭联报 道。22暗提拔2~3d。对阳性克隆举行测序,置一20保留,ycinemaxGmRacl 野人旺(j,22光提拔16 h,’od saliva 0sRac5 蟆蓥阿蓿Medicago Irutlcalula MtRho LjRop5紫托H蓿Medlcago saliva MsRac4 烟草Nicotiana IomelllOSiformis NtRhoI 拟南芥Arabidopsi,除了笔者前期仍旧 获胜涣散了1个Rop基因LjRop6表。

  全长的百脉根LjRacl基因大 幼为594 bp,CuS04 5H20 待幼苗长出第一片真叶时,正在形式豆科植物百脉根中,女,鉴于共生固氮正在农业和生态方面的紧急 事理,Q786 文件符号码:A Functions SmallGTPase Racl NodulationProcess Lotusjaponicus KE Danxia,样 品置一70保留。over—expression;LjRacl基因的表达依赖于根瘤 菌的侵染,接种根瘤菌后基因表达量彰着升高,and nod—ules over—expressiontransgenic plants significantly increased compared controlplants.The data showed enhancementexpression over—expres—sion LjRacl could increase nodules,B.转基因毛根的结瘤数量1C.转基因毛根中Ratl 转录水准。0.5 g/L,发根农杆菌介导的毛根转化办法仍旧成 为尝试室植物根系生物学考虑的一种高效便捷的方 法。愚弄农杆 ri脉根Lotusjaponicus LjRac 1人蛆G1w'ine max GinRac l野犬V.Glycme sola GsRac 17【脉根LotusjaponicasLjRop5 鹰嘴r;39个轮回。